La cytométrie en flux est une méthode de recherche cytologique utilisée pour l'analyse approfondie des cellules. Son avantage est qu'il permet d'étudier chaque cellule individuellement. Ce type d'analyse permet d'évaluer plusieurs paramètres dans des centaines de cellules en quelques secondes. En conséquence, la cytofluorimétrie est considérée comme l'une des méthodes d'analyse les plus rapides et les plus précises actuellement disponibles pour les scientifiques et les cliniciens.
Principe
Le principe de la cytométrie en flux repose sur la mesure de la diffusion de la lumière et de la luminescence (fluorescence) des cellules. La suspension cellulaire est passée sous forme de flux à grande vitesse à travers la cellule du cytomètre, où elle est irradiée avec un laser. La focalisation dite hydrodynamique y est également effectuée. Son mécanisme est que le flux de la cellule avec les particules étudiées à la sortie s'écoule dans le jet externe, qui a une vitesse plus élevée. En conséquence, les particules sont alignées dans une chaîne ordonnée.
Les pré-cellules sont marquées avec des colorants fluorescents spéciaux (fluorochromes). Grâce à eux, le faisceau laserexcite une lueur secondaire. Les signaux lumineux reçus sont enregistrés par des détecteurs. Par la suite, les informations sont traitées à l'aide d'algorithmes logiciels qui vous permettent de compter les populations de cellules individuelles qui diffèrent selon certains critères.
La recherche avec la microscopie conventionnelle échoue souvent à distinguer les différentes cellules parce qu'elles se ressemblent. La cytofluorimétrie peut fournir d'autres données (intégrité de la structure de l'ADN), analyser l'expression des protéines, la survie des cellules.
L'excitation des fluorochromes nécessitant des faisceaux lumineux de différentes longueurs d'onde, ainsi que différents types de détecteurs, les installations modernes sont équipées de plusieurs canaux de détection (de 4 à 30). Le nombre d'émetteurs laser peut aller de 1 à 7. Des dispositifs plus complexes permettent des études multiparamètres de plusieurs propriétés de particules à la fois.
Avantages et inconvénients
Les avantages de la cytométrie en flux incluent:
- haute vitesse de traitement (enregistrement jusqu'à 30 000 événements en 1 seconde);
- possibilité d'étudier un grand nombre de cellules (jusqu'à 100 millions dans un échantillon);
- Quantification de l'intensité de la lumière fluorescente;
- analyse de chaque cellule;
- étude simultanée de processus hétérogènes;
- séparation automatique des données par populations de cellules;
- visualisation de qualité des résultats.
Une autre caractéristique de cette technologie est quela particule analysée peut être colorée avec plusieurs solutions fluorescentes. Grâce à cela, une étude multi-paramètres a lieu.
Les inconvénients incluent la complexité de l'équipement technique et la nécessité d'une préparation spéciale des échantillons.
Cytomètres
Les premiers appareils de ce type sont apparus déjà en 1968 en Allemagne, mais ils se sont répandus bien plus tard. Actuellement, tous les appareils qui fonctionnent selon la méthode de la cytométrie en flux peuvent être divisés en 2 types:
- appareils qui mesurent le rayonnement fluorescent (deux longueurs d'onde ou plus), la diffusion de la lumière à 10° et 90° (détecteur à faible angle et à diffusion latérale);
- appareils qui, en plus de mesurer plusieurs paramètres cellulaires, trient automatiquement en groupes selon ces critères.
Le détecteur de diffusion vers l'avant est conçu pour déterminer la taille de la cellule, et le dispositif de diffusion latérale vous permet d'obtenir des informations sur la présence de granules intracellulaires, le rapport de volume du cytoplasme et du noyau.
Les cytomètres classiques, contrairement aux microscopes optiques, ne permettent pas d'obtenir une image d'une cellule. Cependant, ces dernières années, des dispositifs combinés ont été développés, capables de combiner les capacités d'un microscope et d'un cytofluorimètre. Ils seront discutés ci-dessous.
Cytomètres d'imagerie
Pour les instruments utilisés en cytométrie en flux classique,une caractéristique est caractéristique: si des événements rares sont enregistrés dans la population de cellules analysées, il n'y a aucun moyen d'évaluer leur essence. Ces particules peuvent être soit les restes de cellules mortes, soit un groupe rare d'entre elles. Dans les dispositifs conventionnels, ces données sont exclues du flux général des événements, mais ce sont elles qui peuvent être particulièrement utiles pour l'analyse scientifique et clinique.
La nouvelle génération de cytomètres en flux d'imagerie vous permet de capturer une image de chaque cellule passant dans le flux à travers la zone du détecteur. Il est facile de le voir en cliquant sur la zone correspondante du diagramme, qui s'affiche sur l'écran de l'ordinateur.
Domaines d'application
La cytométrie en flux est une méthode universelle utilisée dans de nombreux domaines de la médecine et de la science:
- immunologie;
- oncologie;
- transplantologie (greffe de moelle osseuse rouge, cellules souches);
- hématologie;
- toxicologie;
- biochimie (mesure de l'acidité à l'intérieur de la cellule, étude d'autres paramètres);
- pharmacologie (création de nouveaux médicaments);
- microbiologie;
- parasitologie et virologie;
- océanologie (l'étude du phytoplancton pour évaluer l'état des masses d'eau et d'autres tâches);
- analyse des nanotechnologies et des microparticules.
Immunologie
Le système immunitaire humain se compose d'une grande variété de cellules. La cytométrie en flux en immunologie permet d'évaluer leur structure et leurs fonctions, c'est-à-dire de réaliser des analyses morphofonctionnellesanalyse.
De telles recherches aident à comprendre la nature complexe de l'immunité. Les phénotypes cellulaires changent en raison de l'activation par des antigènes, du développement de pathologies et d'autres facteurs. La cytofluorométrie peut séparer des sous-populations de cellules immunitaires dans un mélange complexe et évaluer toutes leurs modifications dans le temps.
Oncologie
L'une des tâches les plus importantes en oncologie est la différenciation des cellules en fonction de leur type. Le principe de l'analyse par cytométrie en flux en oncohématologie repose sur le phénomène suivant: lorsqu'un échantillon est traité avec un colorant fluorescent spécial, il se lie aux protéines cytoplasmiques. Après division en cellules en prolifération active, son contenu diminue de moitié. En conséquence, l'intensité de la luminescence cellulaire diminue de deux fois.
Il existe d'autres moyens de détecter les cellules proliférantes:
- utilisation de colorants liant l'ADN (iodure de propidium);
- utilisation d'uracile étiqueté;
- enregistrement d'un niveau accru d'expression des protéines cyclines, impliquées dans la régulation du cycle cellulaire.
