PCR, ou réaction en chaîne par polymérase, est une technique de laboratoire sophistiquée largement utilisée en médecine et dans d'autres domaines scientifiques. Le diagnostic PCR est devenu à un moment donné une véritable percée scientifique.
Description
La PCR quantitative est un type de PCR en temps réel.
Ceci est compris comme une variante de la PCR, dans laquelle la cinétique de la réaction est constamment enregistrée, ce qui permet d'évaluer qualitativement le contenu de séquences nucléotidiques d'ADN spécifiques dans un mélange moléculaire complexe.
La méthode PCR quantitative sera discutée plus en détail ci-dessous.
L'essence de l'analyse
Les méthodes culturales et sérologiques sont particulièrement souvent utilisées pour diagnostiquer les infections. Dans le premier cas, les anticorps dirigés contre un agent pathogène infectieux dans le sérum sanguin sont déterminés. Dans le second, du matériel biologique prélevé sur une personne malade est utilisé pour ensemencer un milieu spécifique favorable à la croissance de colonies pathogènes. Diagnostic dans les deuxl'affaire peut durer des jours ou des semaines.
L'examen PCR peut être effectué avec différents matériels biologiques obtenus à partir d'une personne malade. Le sang et d'autres milieux et fluides pathologiques, physiologiques et biologiques agissent comme des échantillons. Vous pouvez faire des excréments ou de l'urine PCR.
Les infections atypiques et virales sont le plus souvent diagnostiquées par PCR quantitative, car elles peuvent ne pas être faciles à diagnostiquer en raison de la nature spécifique du processus pathologique qu'elles provoquent. Pour déterminer de telles infections, il faut du temps, pendant lequel des anticorps commencent à être produits dans le corps, déterminés par des méthodes sérologiques. Mais cela est inacceptable dans certains cas.
Méthode d'exécution
Méthode PCR - détection en laboratoire de l'infection dans des échantillons isolés du patient (in vitro).
Pour effectuer une réaction en chaîne par polymérase, un ensemble de réactifs spéciaux est nécessaire.
Le matériel de test est introduit dans des tubes à essai avec des réactifs. Les tubes à essai sont placés dans un appareil spécial - un amplificateur PCR, qui est conçu pour amplifier (augmenter le nombre) des fragments d'ARN ou d'ADN souhaités, l'amplificateur PCR fonctionne en mode cyclique. Dans n'importe quel cycle, si les échantillons contiennent la séquence d'ARN ou d'ADN de l'agent pathogène, de plus en plus de copies des particules de ces acides nucléiques s'accumulent dans la solution. Vous pouvez déterminer la présence de l'agent pathogène et sa quantité dans les échantillons.
Types de PCR
L'analyse qualitative par PCR permet d'obtenir le résultat suivant:
- négatif lorsque l'agent pathogène d'intérêt n'est pas trouvé dans les échantillons;
- positif si des séquences sont trouvées dans les échantillons qui sont caractéristiques d'un agent pathogène particulier.
Avec un résultat PCR positif, nous pouvons parler avec une précision de 95 % de la présence d'une infection diagnostiquée. Dans le même temps, la précision des kits PCR utilisés à des fins de diagnostic atteint 100 %.
Habituellement, 5 % des résultats incorrects sont déterminés par le facteur humain. Par exemple, les violations de la technique d'analyse et de stockage des réactifs peuvent réduire considérablement la précision de l'étude.
La PCR quantitative définit le concept de charge virale. Il est possible de déterminer combien d'ensembles d'ADN pathogène se trouvaient dans les échantillons prélevés sur le patient.
La gravité de l'infection est directement proportionnelle à l'augmentation de leur nombre. Vous pouvez également déterminer le succès de la thérapie pour réduire la charge virale.
Soumission pour biomatériel PCR
La PCR quantitative est réalisée en clinique, principalement le matin. Lors d'une visite chez le médecin, le patient sera informé de ce qu'il doit prendre: grattage, frottis, urine ou sang. La PCR peut détecter des agents pathogènes quel que soit le niveau de contamination du matériel.
Pour une analyse positive, en théorie, la présence d'un seul agent pathogène dans les échantillons est requise. En pratique, ils essaient de créer des conditions encore plus favorables. Il y a quelques recommandations pour cela:
- s'ils prélèvent un grattage ou un prélèvement sur les organes génitauxorganes, vous devez vous abstenir de rapports intimes trois jours avant l'étude;
- vous ne pouvez pas vous doucher avec des médicaments antibactériens ou vous laver avant l'analyse;
- trois heures avant de prendre un frottis de l'urètre, vous devez être patient et ne pas vider vos intestins.
Ne suivez pas ces règles lorsque vous donnez du sang.
Comment les résultats de l'analyse PCR quantitative sont-ils interprétés ?
Évaluation quantitative des résultats obtenus
Dans un certain nombre de situations cliniques, le problème de l'efficacité du traitement et / ou de la dynamique du processus pathologique apparaît. Ces questions sont particulièrement pertinentes lors de l'examen de personnes atteintes d'infections chroniques (virus de l'immunodéficience humaine, hépatites B et C). Lors du diagnostic, ils se basent sur le fait que l'accumulation d'amplicons (produits PCR) est proportionnelle à la présence de copies du gène recherché dans l'échantillon analysé.
Bien sûr, la prise en compte des résultats de la PCR quantitative se fait par électrophorèse sur gel avec l'étude de l'intensité des signaux PCR particuliers. De plus, une condition préalable à une évaluation quantitative correcte des résultats obtenus est des échantillons de contrôle fiables positifs contenant un nombre connu de copies du gène souhaité (par exemple, mille copies du gène de l'hépatite C pour une réaction PCR). Plusieurs dilutions en série du contrôle quantitatif permettent de générer des courbes d'étalonnage et sont utilisées pour évaluer le contenu des génocopies cliniques dans les échantillons cliniques.
Dans la définition de la PCR quantitative, une réalisation clé a été la créationdes sondes d'ADN fluorescentes qui sont ajoutées au mélange réactionnel simultanément avec des amorces simples et vous permettent de suivre le processus de PCR dans le temps, c'est-à-dire la PCR en temps réel.
La méthodologie TaqMan fait référence à la synthèse de sondes d'ADN fluorescentes spécifiques à la partie médiane de l'amplicon et dotées de deux marqueurs aux extrémités. L'un d'eux est un marqueur fluorescent, le second est une molécule d'extinction de cette fluorescence.
Un appareil spécial, qui est un hybride d'un fluorimètre et d'un thermobloc-amplificateur, effectue des mesures constantes de fluorescence dans chaque tube à essai (principe de la PCR en temps réel). Après 20 à 40 cycles de PCR, des courbes individuelles seront obtenues pour chaque échantillon. Le nombre de copies du gène souhaité contenu dans l'échantillon de test peut être calculé à partir des courbes d'étalonnage avec des échantillons de contrôle.
De plus, une caractéristique importante de la mise en œuvre de la PCR par la méthode fluorescente est qu'il n'est pas nécessaire d'ouvrir des tubes avec un mélange PCR lors de la prise en compte des résultats. Cela réduit la possibilité de contamination de la pièce par des produits d'amplification et il n'est pas nécessaire d'allouer des zones de travail spéciales pour l'électrophorèse.
Que montre une transcription PCR quantitative ?
Qu'est-ce qui est découvert ?
Grâce à une méthode telle que la PCR quantitative, des modifications qualitatives des gènes sont trouvées: insertions, délétions et mutations ponctuelles. Mais avec certaines maladies héréditaires, les symptômes correspondants apparaissent en réponse à une modification du contenu de certains gènes.
MerciL'analyse quantitative donne un résultat chiffré, le plus souvent en UI/ml. Cela signifie que dans un millilitre de l'échantillon à tester, un certain nombre de copies de l'ARN ou de l'ADN de l'agent pathogène, mesuré en unités internationales, a été trouvé.
Selon l'ampleur, la gravité de l'infection est diagnostiquée. Le sang est généralement testé pour déterminer la charge virale, car les virus se déplacent librement dans le sang pendant la maladie.
Caractéristiques
La PCR quantitative dans un test sanguin a deux caractéristiques.
- L'analyse est effectuée en présence d'amorces ou de désoxyribonucléosides triphosphates, qui sont marqués avec un marqueur fluorescent ou radioactif pour déterminer avec précision le contenu du produit PCR formé.
- Dans le processus PCR, arrêtez la réaction tôt avant que trop de produits PCR n'apparaissent. Cela est dû au fait qu'au stade final de saturation, lorsqu'il y a beaucoup de produits de PCR, tant l'enzyme elle-même que les substrats agissent comme les maillons limitants de cette réaction. La fin du cycle de PCR suivant dans de telles conditions n'est plus caractérisée par un doublement du nombre de produits de PCR, des différences quantitatives insignifiantes entre les différents échantillons sont nivelées, qui sont assez clairement définies dans les premiers stades après avoir traversé une série de cycles de réaction.
Coût des diagnostics PCR
La recherche PCR a un coût, qui dépend du type d'infection qui sera testé, de la méthodologie d'analyse et du matériel de test. Pour déterminer une infection, vous devrez donner dans200-800 roubles. Des frais pour la prise de biomatériaux sont également ajoutés - environ 400 roubles.
