La chromatographie est l'une des méthodes de séparation des substances. Il est utilisé pour l'analyse qualitative et quantitative ultérieure des propriétés physiques et chimiques des microparticules. Une variante de cette technologie est la chromatographie d'affinité. L'idée de différencier les composés protéiques en utilisant la propriété d'affinité moléculaire est connue en science depuis plusieurs décennies. Cependant, il n'a connu son développement que ces dernières années, après l'introduction de matériaux hydrophiles très poreux utilisés comme matrice. Cette méthode permet de résoudre à la fois des problèmes analytiques (séparation des substances et leur identification) et des problèmes préparatifs (purification, concentration).
Essence
La chromatographie d'affinité (du mot latin affinis - "adjacent", "lié") est basée sur des interactions d'affinité, qui sont la formation de liaisons hautement spécifiques entre une molécule espaceur (ligand ou affinant) et une molécule cible. Ces mécanismes sont de nature très répandue (association de médiateurs ou d'hormones et de récepteurs, d'anticorps etantigènes, hybridation de polynucléotides et autres types de processus). En médecine, la chromatographie d'affinité est utilisée à des fins pratiques depuis 1951
Les composants sont séparés comme suit:
- la solution de travail contenant la substance à isoler est passée à travers le sorbant;
- ligand déposé sur la matrice sorbante retient cette substance;
- il est concentré (accumulation);
- extraction de la substance isolée du sorbant par lavage avec un solvant.
Cette méthode vous permet d'isoler des cellules entières. La différence avec la chromatographie de sorption traditionnelle est qu'il existe une forte liaison biospécifique du composant isolé au sorbant, qui se caractérise par une sélectivité élevée.
Adsorbants
Les substances suivantes sont utilisées comme adsorbants:
- Composés gélifiés à base d'agarose, un polysaccharide obtenu à partir d'agar. Les plus couramment utilisés sont 3 variétés: sepharose 4B, CL (agarose réticulé) et affi-gel. Cette dernière composition est un gel modifié d'agarose et de polyacrylamide. Il a une plus grande inertie biologique, une haute résistance chimique et thermique.
- Silice (gel de silice).
- Verre.
- Polymères organiques.
Pour éliminer les obstacles mécaniques lors du contact avec le ligand, des substances supplémentaires sont utilisées pour le séparer du support (peptides, diamines, polyamines, oligosaccharides).
Équipement
L'équipement de chromatographie d'affinité comprend les unités principales suivantes:
- réservoirs de stockage pour la phase mobile (éluant);
- pompes haute pression pour alimentation moyenne (le plus souvent à piston);
- filtre pour nettoyer les éluants de la poussière;
- dispositif de dosage;
- colonne chromatographique pour la séparation des mélanges;
- détecteur pour détecter les composants séparés sortant de la colonne;
- enregistreurs de chromatogrammes et unité à microprocesseur (ordinateur).
Afin de réduire la quantité d'air dissous, l'hélium traverse d'abord la phase mobile. Pour modifier la concentration de l'éluant, plusieurs pompes contrôlées par le programmateur sont installées. Les colonnes chromatographiques sont en acier inoxydable (pour des exigences accrues de résistance à la corrosion), en verre (option universelle) ou en acrylique. À des fins de préparation, leur diamètre peut varier de 2 à 70 cm. En chromatographie analytique, on utilise des microcolonnes Ø10-150 µm.
Pour augmenter la sensibilité des détecteurs, des réactifs sont introduits dans le mélange, ce qui contribue à la formation de substances qui absorbent plus de rayons dans la région ultraviolette ou visible du spectre.
Méthodologie
Il existe 2 principaux types de chromatographie liquide d'affinité:
- Colonne, dans laquelle la colonne est remplie d'une phase stationnaire et un mélange y est passé avec un fluxéluant. La séparation peut se produire sous pression ou par gravité.
- Couche fine. L'éluant se déplace le long de la couche adsorbante plate sous l'influence des forces capillaires. L'adsorbant est appliqué sur une plaque de verre, une tige de céramique ou de quartz, une feuille de métal.
Les principales étapes du travail comprennent:
- préparation de l'adsorbant, fixation du ligand sur le support;
- alimentation du mélange de séparation dans la colonne chromatographique;
- chargement de la phase mobile, liaison des composants par le ligand;
- remplacement de phase pour isoler la substance liée.
Destination
La chromatographie d'affinité est utilisée pour isoler les types de substances suivants (le type de ligand utilisé est indiqué entre parenthèses):
- analogues d'inhibiteurs enzymatiques, substrats et cofacteurs (enzymes);
- substances bioorganiques présentant des signes d'extranéité génétique, virus et cellules (anticorps);
- glucides de haut poids moléculaire, polymères monosaccharidiques, glycoprotéines (lectines);
- protéines nucléaires, nucléotidyltransférases (acides nucléiques);
- récepteurs, protéines de transport (vitamines, hormones);
- protéines interagissant avec les membranes cellulaires (cellules).
Cette technologie est également utilisée pour obtenir des enzymes immobilisées, et leur liaison à la cellulose permet la production d'immunosorbants.
Chromatographie des protéines de liaison à l'ADN
L'isolement des protéines de liaison à l'ADN est réalisé à l'aidehéparine. Ce glycosaminoglycane est capable de se lier à un large éventail de molécules. La chromatographie d'affinité des protéines de ce groupe est utilisée pour isoler des substances telles que:
- facteurs d'initiation et d'allongement de la traduction (synthèse de molécules d'acide nucléique et de protéines);
- restrictases (enzymes qui reconnaissent certaines séquences dans l'ADN double brin);
- ADN ligases et polymérases (enzymes qui catalysent la jonction de deux molécules pour former une nouvelle liaison chimique et sont impliquées dans la réplication de l'ADN);
- les inhibiteurs de la sérine protéase qui jouent un rôle important dans les processus immunitaires et inflammatoires;
- facteurs de croissance: fibroblaste, Schwann, endothélial;
- protéines de la matrice extracellulaire;
- récepteurs hormonaux;
- lipoprotéines.
Dignité
Cette méthode est l'une des plus spécifiques pour l'isolement de composés réactifs (enzymes et agrégats plus gros - virus). Cependant, il n'est pas seulement utilisé pour isoler des substances biologiquement actives.
Détection d'anticorps en petite quantité, évaluation quantitative de l'acide polyadénylique, détermination rapide des masses moléculaires des déshydrogénases, élimination de certains polluants, étude de la cinétique d'activation de la forme inactive de la trypsine, la structure moléculaire de l'humain interférons - ce n'est pas toute la liste des études dans lesquelles l'affinité est utilisée chromatographie. L'utilisation en clinique est due à ses avantages tels que:
- Capacité de nettoyage efficaceprotéines, polysaccharides, acides nucléiques. Ils diffèrent légèrement dans leurs propriétés physiques et chimiques et perdent leur activité lors de l'hydrolyse, de la dénaturation et d'autres types de traitement utilisés dans d'autres méthodes.
- La vitesse de séparation des substances, la nature dynamique du processus.
- Pas besoin de purification enzymatique spéciale et d'homogénéisation des isoenzymes pour déterminer les constantes de dissociation.
- Capable de séparer un large éventail de substances.
- Faible consommation de ligands.
- Possibilité de séparation de substances en grands volumes.
- Processus réversible de liaison de macromolécules biologiques.
Cette technique peut être combinée avec d'autres, pour imposer un champ supplémentaire (gravitationnel, électromagnétique). Cela vous permet d'étendre les capacités techniques de la chromatographie.
Ingénierie enzymatique
Grâce à cette méthode, le développement actif d'une nouvelle branche de la biotechnologie - l'ingénierie enzymatique a commencé.
La chromatographie d'affinité pour l'isolement d'enzymes présente les avantages suivants:
- l'obtention d'enzymes en grande quantité en moins de temps, en raison de leur réduction de prix;
- l'immobilisation des enzymes peut considérablement étendre la portée de leur application en médecine et dans l'industrie;
- L'association d'enzymes à un support solide insoluble permet d'étudier l'influence du microenvironnement et le sens des réactions, qui jouent un rôle important dans les processus naturels et physiologiques.
